摘 要] 四环素类药物为广谱抗生素,广泛用于临床治疗,并常被用做动物促生长剂,但耐药性的出现限制了该类药物的使用。四环素类药物产生耐药性的机制主要有核糖体保护作用、外输泵作用及产生钝化酶等。本文详细综述了其耐药机制的研究进展及耐药基因的发生率。

[关键词] 四环素类抗生素;耐药机制;研究进展

四环素类药物为广谱抗生素,发现于20世纪40年代,是通过阻止氨酰ｔＲＮＡ与核糖体结合位点(Ａ)的结合来阻止菌体蛋白合成的一类抗生素,具有广泛的抗菌活性。在临床中以其有效的杀菌作用及较小的副作用而被广泛用于治疗人和动物的细菌性感染。此外,在包括美国在内的一些国家,四环素还被大量用作生长促进剂投喂给动物。近年来,耐药性的出现限制了它们的使用。在20世纪50年代中期以前,主要的共生菌和病原菌都对四环素敏感,例如,1917～1954年分离到的433株不同的肠杆菌仅2%对四环素耐药。而Ｌｉｍａ等的研究表明,1988～1993年间60%的Ｓ.ｆｌｅｘｎｅｒｉ分离株对四环素、链霉素和氯霉素耐药。

耐药性研究的深入为新药的开发提供了机会,但更深层次的研究首先需要对细菌耐药机制有一个更全面的了解。本文介绍了四环素类抗生素耐药机制的最新研究进展。

1 四环素类抗生素家族

20世纪40年代发现了四环素家族的首批成员金霉素(ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ,氯四环素)和土霉素(ｏｘｙｔｅ ｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ,氧四环素),随后又相继发现其他四环素类药物,其中有些为天然分子,如四环素(ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ);有些为半化学合成产品,如美他环素(ｍｅｔｈａｃｙｃｌｉｎｅ,甲烯土霉素)、多西环素(ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ)和美满霉素(ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ,米诺环素)等。随着研究的不断深入,水溶性好或口服吸收率高的新型半合成药物如罗利环素(ｒｏｌｉｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ)和赖甲环素(ｌｙｍｅｃｙｃｌｉｎｅ)相继问世;最新研制出的甘氨酰环素已完成Ⅰ期临床试验,目前正在进行Ⅱ期临床试验[1,2]。而一些早期的药物,如氯莫环素(ｃｌｏｍｏｃｙｃｌｉｎｅ)、罗利环素、赖甲环素和金霉素在各国都已不再使用。

2 四环素类抗生素的作用机理

四环素类药物具有抗菌活性的最重要特征是每种药物的分子中都包括一个线性熔合的四环素核。结构最简单的具有抗菌活性的四环素分子是6-脱氧-6-去甲基四环素,此结构被认为是最小的药效基团。四环素类抗生素通过阻止氨酰ｔＲＮＡ与细菌核糖体结合来抑制细菌蛋白质合成,四环素分子必须通过一个或多个膜系统(革兰氏阳性菌和阴性菌各自具有不同的膜系统)才能与它们的靶位结合,从而达到有效的杀菌作用。因此,在探讨四环素作用方式时需考虑到跨膜吸收和核糖体结合这两种机制。

四环素穿越革兰氏阴性肠道菌外膜是以被动转运阳离子(可能是Ｍｇ2+)-四环素复合物的形式经ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣ孔蛋白通道,并在道南(Ｄｏｎｎａｎ)电位作用下穿过外膜进入细胞在胞外质中积累。在胞外质中四环素分子被分解释放,并通过扩散作用穿过内膜(细胞质膜)的脂质双层最终进入细胞内。四环素类药物穿越革兰氏阳性菌细胞质膜的方式则是形成电中性亲脂分子,是能量依赖性的,并由细胞内外的Ｈ+浓度差所驱动。在细胞质中Ｈ+和二价阳离子浓度都高于细胞外,所以细胞质内的四环素分子可能被螯合,形成Ｍｇ2+-四环素复合物与核糖体结合。

3 四环素类抗生素耐药的分子机制

1980年Ｍｅｎｄｅｒ等第1次研究肠杆菌科和假单胞菌质粒的四环素耐药决定子的基因机制,到现在已经明确了29个不同的ｔｅｔ基因和3个ｏｔｒ基因,其中18种ｔｅｔ基因和1种ｏｔｒ基因编码外输泵,7种ｔｅｔ基因和1种ｏｔｒ基因即ｏｔｒ(Ａ)编码核糖体保护蛋白,1种ｔｅｔ基因即ｔｅｔ(Ｘ)编码一种修饰或钝化四环素的酶,但ｔｅｔ(Ｘ)基因的功能在天然宿主中并不能起作用。

3.1 外输泵蛋白(Ｅｆｆｌｕｘｐｒｏｔｅｉｎ) 在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中都有外输泵基因,而且大部分外输泵基因都具有四环素抗性。四环素外输泵蛋白属于主要异化超家族(ＭＦＳ),是目前Ｔｅｔ蛋白中研究最清楚的。所有ｔｅｔ外输泵基因都编码膜相关蛋白可将四环素泵出胞外,降低了细胞内药物浓度保护了胞内的核糖体,从而产生耐药性。

每个ｔｅｔ外输泵基因都编码约46ｋｕ膜结合外输泵蛋白,这些蛋白依据氨基酸的同源性可分为6个群:第1群蛋白包括Ｔｅｔ(Ａ)、Ｔｅｔ(Ｂ)、Ｔｅｔ(Ｃ)、Ｔｅｔ(Ｄ)、Ｔｅｔ(Ｅ)、Ｔｅｔ(Ｇ)、Ｔｅｔ(Ｈ)、Ｔｅｔ(Ｚ),还可能有Ｔｅｔ(Ｉ)、Ｔｅｔ(Ｊ)和Ｔｅｔ(30)[3]。该群蛋白具有12个跨膜α-螺旋,其四环素抗性蛋白具有41%～78%的氨基酸同源性,而它们的四环素阻抑蛋白具有37%～88%的氨基酸同源性。该群蛋白的基因大部分只存在于革兰氏阴性菌中,只有ｔｅｔ(Ｚ)存在于革兰氏阳性菌中。许多外输泵蛋白存在于双分子脂膜中,以亲水氨基酸环凸出到周质和细胞质空间,外输泵蛋白逆浓度梯度将四环素-阳离子复合物泵出胞外[4]。

革兰氏阴性菌外输泵基因分布广泛,通常与大质粒相连,且大多为结合性质粒。这些外输泵基因大都来源于不同的不相容质粒群[5],这些质粒通常也携带其他抗性基因(如抗金属基因)和病原因子基因(如毒素基因)。因此,介导任何一种抗性因子就是传递携带多重抗性的质粒,这一交叉选择的现象可能是细菌多重耐药现象日趋严重的重要原因之一。

第2群蛋白包括Ｔｅｔ(Ｋ)和Ｔｅｔ(Ｌ)。该群蛋白具有14个跨膜α-螺旋,它们具有58%～59%的氨基酸同源性。这些蛋白主要存在于革兰氏阳性菌中。ｔｅｔ(Ｋ)和ｔｅｔ(Ｌ)基因主要存在于小的传递性质粒中,它们偶尔会整合入葡萄球菌染色体、枯草杆菌染色体或金黄色葡萄球菌的大质粒中。葡萄球菌的大质粒携带ｔｅｔ(Ｋ)相对不常见,而小质粒携带ｔｅｔ(Ｋ)基因则较普遍。小质粒代表了一族密切相关的质粒,其大小为4.4～4.7ｋｂ。ｐＴ181质粒是这一族的代表,已测出全序。ｐＴ181还可携带除ｔｅｔ(Ｋ)外的其他抗药基因。少数质粒携带的ｔｅｔ(Ｌ)已被测序,相互之间具有98%～99%的同源性。较为特殊的是枯草杆菌染色体上的ｔｅｔ(Ｌ),该基因与其他ｔｅｔ(Ｌ)基因序列仅有87%的同源性。

第3群蛋白包括Ｏｔｒ(Ｂ)和Ｔｃｒ3,发现于链霉菌属,这些蛋白与第2群蛋白的拓扑结构相似,具14个跨膜α-螺旋。第4群蛋白包括ＴｅｔＡ(Ｐ),分离于梭菌属,具有12个跨膜α-螺旋。第5群蛋白包括从耻垢分支杆菌分离到的Ｔｅｔ(Ｖ)。第6群蛋白包括从纹带棒状杆菌分离到的未命名的蛋白,其被认为是利用ＡＴＰ而不是质子泵作为能源的。

3.2 核糖体保护蛋白(Ｒｉｂｏｓｏｍａｌｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ)

已知9种核糖体保护蛋白,这些存在于细胞质中的蛋白具有保护核糖体免受四环素作用,使细菌具有抵抗多西环素和美满霉素的能力,且耐药谱比携带不含ｔｅｔ(Ｂ)外输泵基因的细菌广泛。有资料说明核糖体保护蛋白与核糖体结合可引起核糖体构型的改变,使四环素不能与其结合,但并不改变或阻止蛋白的合成。ＧＴＰ水解可提供核糖体构型变化所需的能量。核糖体保护蛋白与延伸因子ＥＦ-Ｔｕ和ＥＦ-Ｇ有同源性,它们与核糖体的结合是竞争性的。核糖体保护蛋白和ＥＦ-Ｇ在核糖体上有重叠的结合位点,核糖体保护蛋白需从核糖体上游离下来使ＥＦ-Ｇ与核糖体结合[6,7]。

Ｔｅｔ(Ｍ)和Ｔｅｔ(Ｏ)蛋白是研究得最多的核糖体保护蛋白,它们具有核糖体依赖的ＧＴＰ水解酶活性。无论是Ｔｅｔ(Ｍ)还是Ｔｅｔ(Ｏ)蛋白,当有ＧＴＰ而不是ＧＤＰ存在时就会使四环素与核糖体的结合能力减弱[3,8]。

尽管在这一群中只有两个蛋白被广泛研究,但其他核糖体保护蛋白Ｔｅｔ(Ｓ)、Ｔｅｔ(Ｔ)、Ｔｅｔ(Ｑ)、ＴｅｔＢ(Ｐ)、Ｔｅｔ(Ｗ)和Ｏｔｒ(Ａ)的氨基酸序列与Ｔｅｔ(Ｍ)和Ｔｅｔ(Ｏ)具有相似性,因此也可能具有ＧＴＰ水解酶活性,以同样的方式与四环素和核糖体相互作用。核糖体保护蛋白可根据氨基酸的同源性分类。第一类包括Ｔｅｔ(Ｍ)、Ｔｅｔ(Ｏ)、Ｔｅｔ(Ｓ)和新发现的Ｔｅｔ(Ｗ)蛋白,第二类包括Ｏｔｒ(Ａ)和ＴｅｔＢ(Ｐ)蛋白,第三类包括Ｔｅｔ(Ｑ)和Ｔｅｔ(Ｔ)蛋白[9]。

3.3 灭活或钝化四环素的酶(Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ) ｔｅｔ(Ｘ)基因是唯一通过产生灭活四环素的酶而耐药的。已报道两株厌氧拟杆菌转座子上携带有ｔｅｔ(Ｘ)基因。ｔｅｔ(Ｘ)产生44ｋｕ胞浆蛋白,它在氧和ＮＡＤＰＨ存在时可化学修饰四环素,序列分析表明这个酶与其他ＮＡＤＰＨ需要的氧化还原酶有同源性。

3.4 其他(未知)耐药机制(Ｏｔｈｅｒ/ｕｎｋｎｏｗｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ) Ｔｅｔ(Ｕ)蛋白有低水平的耐四环素能力。其基因编码的11.8ｋｕ蛋白包括105个氨基酸,比外输泵蛋白(45ｋｕ)和核糖体保护蛋白(72ｋｕ)小。链霉菌ｏｔｒ(Ｃ)基因序列尚未见报道,推测ｏｔｒ(Ｃ)基因并不编码外输泵和核糖体保护蛋白,但ｏｔｒ(Ｃ)是否与ｔｅｔ(Ｘ)类似编码钝化酶,或与ｔｅｔ(Ｕ)类似具有一种新的耐药机制尚不明确。

4 四环素类抗生素耐药基因的发生率

4.1 病原菌或条件致病菌(Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃａｎｄｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓ ｔｉｃｏｒｇａｎｉｓｍｓ) 病原菌或条件致病菌中的大部分ｔｅｔ基因与转移质粒、转座子、结合转座子相连,这些转移单位可使ｔｅｔ基因在种间传递或通过结合在更大范围的属间传递[10]。最初在肠杆菌科和假单胞菌中发现的革兰氏阴性菌ｔｅｔ基因现也在奈瑟菌属、嗜血杆菌属、密螺旋体和弧菌属中相继发现。ｔｅｔ(Ｂ)基因在革兰氏阴性菌ｔｅｔ基因中具有最为广泛的宿主,现已在20种革兰氏阴性菌属中被检测到[11]。然而,ｔｅｔ(Ｍ)已在26个革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中检测到。一些基因如ｔｅｔ(Ｅ)的宿主范围可能较为有限,因为它们定位于不可转移的质粒上,由此减少了向其他种属转移的机会。一些种属中的ｔｅｔ基因仅表现较低的耐药水平,不能保护存在于临床和环境四环素浓度下的细菌。

革兰氏阳性菌也可获得四环素抗性质粒,特别是在多重耐药中更为普遍。1994年的研究资料显示,大约90%耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、70%无乳链球菌、70%多药耐药粪肠球菌都具四环素抗性。

“革兰氏阴性菌ｔｅｔ基因”是指那些只在革兰氏阴性菌中被发现的基因。这些基因的Ｇ+Ｃ含量(>40%)高于来源于革兰氏阳性菌的基因。所有革兰氏阴性菌基因都编码外输泵蛋白,但如果转入革兰氏阳性菌宿主中则不能高效表达。很多革兰氏阴性菌ｔｅｔ基因受阻抑子调控,与结构基因转录方向相反。“革兰氏阳性菌ｔｅｔ基因”通常是指发现于革兰氏阳性菌中,具有相对较低的Ｇ+Ｃ含量(≤35%)的基因,但目前在越来越多的革兰氏阴性菌中发现具有该基因,尤以ｔｅｔ(Ｍ)基因最为突出,现已从临床分离的8种革兰氏阴性菌、18种革兰氏阳性菌中被检出。此外,实验室中可将ｔｅｔ(Ｍ)基因转入更多的菌属中[12]。

严格胞内寄生的病原体如衣原体和立克次氏体还未获得四环素抗性,因为这些病原体存在于细胞内,只有细胞同时被两种病原体感染才可能发生基因交换。但突变导致的耐药性上升则更可能发生在这些胞内寄生的病原体中[13]。

4.2 共生菌(Ｃｏｍｍｅｎｓａｌｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ) 共生菌与机会致病菌及病原菌具有相同的ｔｅｔ基因、质粒、转座子和结合性转座子,如肺炎链球菌和化脓链球菌及许多口腔草绿色链球菌都可获得的ｔｅｔ(Ｍ)、ｔｅｔ(Ｏ)、ｔｅｔ(Ｌ)和ｔｅｔ(Ｋ)基因。此外,在长期药物压力选择下,革兰氏阳性菌具有从携带一个ｔｅｔ基因转为携带多重ｔｅｔ基因的趋势。在个别革兰氏阳性菌中可找到不同种类的多重ｔｅｔ基因盒,如分枝杆菌和链球菌,但在革兰氏阴性菌中特别是肠道菌中则不常见[14]。

总之,已经发现很多致病性的革兰氏阴性菌属携带的四环素抗性基因与同属的共生菌相同。革兰氏阴性菌如嗜血杆菌、奈瑟氏菌和拟杆菌,革兰氏阳性菌属如链球菌都携带与条件致病菌相同的ｔｅｔ基因。因此,共生菌具有作为病原菌ｔｅｔ基因或其他抗性基因储藏库的作用,并有助于说明细菌菌群保持和传播抗生素抗性基因的机理。

5 ｔｅｔ基因的分布和转移

ｔｅｔ基因广泛存在于从人、动物和环境中分离的细菌中,大多数ｔｅｔ基因都与结合或移动元素相连,这可以部分解释为什么它们在细菌中能广泛分布。革兰氏阴性菌中ｔｅｔ外输泵基因发现于转座子,并可插入到不同的不相容质粒中。革兰氏阳性菌外输泵基因与小质粒相连,核糖体保护蛋白基因ｔｅｔ(Ｓ)和ｔｅｔ(Ｏ)可以存在于结合质粒或染色体上,在染色体上它们不能自己移动。ｔｅｔ(Ｍ)和ｔｅｔ(Ｑ)基因主要与结合染色体元素相连,并编码它们自己的转移。这些结合转座子转移可将质粒移动到其他菌属中[5]。

5.1 革兰氏阴性细菌 目前39个革兰氏阴性菌属、23个革兰氏阳性菌属及相关菌属的耐四环素机制已经被阐明。其他尚未明确的ｔｅｔ基因可能存在,因为已检测出不携带现有ｔｅｔ基因的四环素耐药株。新的抗四环素基因不断被发现,新的菌属也被检出携带ｔｅｔ基因。ｔｅｔ(Ａ)、ｔｅｔ(Ｂ)、ｔｅｔ(Ｃ)、ｔｅｔ(Ｄ)、ｔｅｔ(Ｅ)、ｔｅｔ(Ｇ)、ｔｅｔ(Ｈ)、ｔｅｔ(Ｉ)、ｔｅｔ(Ｊ)、ｔｅｔ(Ｙ)、ｔｅｔ(30)和ｔｅｔ(31)基因在革兰氏阴性菌属中广泛存在,这些菌属中大部分属肠道菌群。ｔｅｔ(Ｂ)基因在革兰氏阴性菌中最为广泛,已在不同细菌中检出,如放线共生放线杆菌、流感嗜血杆菌、莫拉杆菌和齿垢密螺旋体[16]。

革兰氏阴性菌中发现的ｔｅｔ基因的数量是不同的,既有携带一种ｔｅｔ基因,如ｔｅｔ(Ｂ)、ｔｅｔ(Ｍ)或ｔｅｔ(Ｑ),也有发现于埃希氏菌属中多达七条ｔｅｔ外输泵基因。然而,已经发现大肠杆菌质粒携带不超过一种类型的ｔｅｔ基因。相反,链霉菌属和革兰氏阳性菌属个别分离株常携带多个基因,编码相同的抗生素抗性,包括四环素抗性。ｔｅｔ(Ｇ)、ｔｅｔ(Ｈ)和ｔｅｔ(Ｉ)基因在革兰氏阴性菌中很少检出。科学家们仍在研究某些菌属只携带一种ｔｅｔ基因,而另一些菌属则可携带一系列不同的ｔｅｔ基因的原因。

对革兰氏阴性菌质粒不相容群的研究发现,它们决定其细菌宿主的范围,质粒宿主的变化范围非常严格,如嗜血杆菌携带的结合性大Ｒ-质粒,在本菌属外其他宿主中就不能存在。这些质粒宿主范围可能影响到与它们相连的部分ｔｅｔ基因的传播[5]。

目前,8种革兰氏阴性菌属携带ｔｅｔ(Ｍ)基因,7种携带ｔｅｔ(Ｑ),5种携带ｔｅｔ(Ｗ),2种携带ｔｅｔ(Ｏ),2种携带ｔｅｔ(Ｋ),各有1种携带ｔｅｔ(Ｈ)、ｔｅｔ(Ｉ)、ｔｅｔ(Ｊ)、ｔｅｔ(Ｙ)、ｔｅｔ(30)、ｔｅｔ(31)。根据它们较低Ｇ+Ｃ含量,ｔｅｔ(Ｋ)、ｔｅｔ(Ｌ)、ｔｅｔ(Ｍ)、ｔｅｔ(Ｏ)、ｔｅｔ(Ｐ)、ｔｅｔ(Ｓ)、ｔｅｔ(Ｔ)、ｔｅｔ(Ｑ)、ｔｅｔ(Ｗ)[17],可能还有ｔｅｔ(Ｚ)被认为来源于革兰氏阳性菌中。这证明了来源于革兰氏阳性菌的抗生素抗性基因,特别是核糖体保护蛋白基因可以通过细菌污染在种、属间进行交换,并可成功的整合和表达于一系列不同背景的宿主中的假说。

5.2 革兰氏阳性细菌 目前,已知17种革兰氏阳性菌及霉形体属、脲原体属、放线菌属、诺卡氏菌属、分枝杆菌和链霉菌属等都携带已知的耐四环素基因。但并不是所有耐四环素革兰氏阳性菌都有确切的ｔｅｔ基因[14]。共计有18个属携带ｔｅｔ(Ｍ)、11个属携带ｔｅｔ(Ｋ)、10个属携带ｔｅｔ(Ｌ)、7个属携带ｔｅｔ(Ｑ)、5个属携带ｔｅｔ(Ｏ)、2个属携带ｔｅｔ(Ｓ)、1个属携带ｔｅｔ(Ｐ)基因。近年来发现双歧杆菌携带ｔｅｔ(Ｗ)基因,棒状杆菌携带ｔｅｔ(Ｍ)以及最新发现的ｔｅｔ(Ｚ)基因,肠球菌中新发现有ｔｅｔ(Ｕ)基因,链球菌中有ｔｅｔ(Ｔ),耻垢分枝杆菌中发现了ｔｅｔ(Ｖ)基因。

ｔｅｔ(Ｋ)、ｔｅｔ(Ｌ)基因不仅广泛分布于从人、动物、水源分离的革兰氏阳性菌中,而且在分枝杆菌、诺卡氏菌属和分离自病人的链霉菌属中也广泛存在。ｔｅｔ(Ｍ)基因通常与Ｔｎ916-Ｔｎ1545族结合转座子相连[18]。这群转座子形成不能复制的环状中间体,这对细胞内的转移和细胞间的结合转移是必要的。Ｃｌｅｗｅｌｌ等研究表明Ｔｎ916族转座子可在自然界中找到或在实验室中转至24个属的50种不同菌中。ｔｅｔ(Ｍ)基因可以被转入更多包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌的其他菌属中。

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