不安全因素及解决方法

不安全因素 外毒素、热源、异体蛋白、内毒素包括革兰氏阴性菌、蛋源、血清和环境。蛋源包括疫苗生产用鸡蛋、SPF鸡蛋(非致病性沙门氏菌、大肠杆菌等污染)、非免疫鸡蛋(鱼粉沙门氏菌污染，定期投入抗生素，减少输卵管炎，蛋壳钙质，畸形蛋)、禽流感疫苗生产用蛋。

疫苗污染ET后注射动物的临床反应 肿头，肿脸，停食停水，局部炎症，休克，死亡；生产性能降低；免疫功能下降，易发病，对疫苗应答下降。

细菌内毒素对细胞培养的影响 改变细胞外形；活化细胞产生信息传递物质，井影响其下游生物；途经反应；抑制维生素活性；影响细胞附着力。

LPS的自发释放：内毒素主要成分是脂多糖(LPS)；抗菌药物诱导细菌释放内毒素；抗菌药物诱导LPS释放的动物实验研究；抗菌药物诱导LPS释放的临床研究。

应用抗生素导致疫苗中内毒素的释放 庆大霉素、环丙沙星、青霉素、链霉素；兔大肠杆菌性脑膜炎���静脉注射头孢噻啶、氯霉素、庆大霉素，在24小时内脑脊液中内毒素升高2倍~10倍，在临床上兔的死亡是大量使用抗生素的结果，因为抗生素杀死了大肠杆菌，大肠杆菌裂解，释放出大量的内毒素，从而将兔杀死。

解决方法

减少原材料和操作的污染；减少动物源性物质的依赖性；改进生产工艺(内毒素的消除)：应用抗内毒素的药物，如内毒素抗体、内毒素结合蛋白(高密度脂蛋白)、多黏菌素B和妥布霉素、类脂A结构类似物(E5531)；抗细胞因子药物如腺苷类药物氯氨酮等，糖皮质激素类如地塞米松等；抗内毒素的中药，如青蒿素、黄连解毒汤，氨基酸如甘氨酸，乳果糖及胆盐。

内毒素的消除���物理方法 超滤、石棉及活性炭吸附、离子交换层析、亲和层析（运用抗内毒素抗体)等。

动物疫苗的质量控制

疫苗生产用毒种、生产用细胞(原代细胞、传代细胞)、疫苗生产工艺、灭活剂、抗生素、血清、佐剂。

疫苗生产用毒种 原始种子：我国自行分离和从国外引进。建立3批种子批。主种子批和工作种子批：主种子批是指原始种子批扩增而来；工作种子批是指从主种子批扩增而建立，三级种子均须按《中国兽药典》要求检验。

疫苗生产用细胞 原代细胞要求：一般1代~5代内，细胞培养用牛血清、胰蛋白酶、培养基等材料应符合《中国生物制品主要原材料质控标准》要求：疫苗生产的每批细胞均应作外源因子检测，细菌、真菌和支原体检查，均应阴性；传代细胞的要求：细胞库的建立：细胞库体系是指每批产品的起始材料具有一致性；细胞库通常为二级管理，由主细胞库和工作细胞库组成；传代细胞传到一定代次后，致瘤性会增强，须进行致瘤性检查和细胞核型分析；细胞的鉴定：细胞鉴别、外源因子污染、致瘤性、细胞核型或染色体检测、外源病毒。

灭活剂 福尔马林：其与病毒蛋白的作用初期仅形成羟甲基化合物，其反应是可逆的，但一旦形成交链后则为不可逆的。福尔马林作用蛋白的结果是病毒发生交联作用或是病毒颗粒凝集。同时，这种作用限制了福尔马林作用于核酸的灭活，因此，在某些情况下尽管病毒抗原已遭到了严重破坏，但仍然会有一些病毒存活。

β-丙内酯优点：直接作用于病毒的DNA或RNA，打断病毒的核酸，使其不能复制遗传物质而起作用，不破坏病毒的外蛋白：β-PL水解成β-羟丙酸(无毒)；疫苗中无残留，不影响疫苗的稳定性，灭活作用可靠。

缺点：β-丙内酯与牛血清白蛋白的结合引起过敏反应。研究发现：接种这种疫苗而导致抗牛白蛋白lgE的产生的原因是由于β-丙内酯与疫苗中的牛白蛋白结合，使这种β-丙内酯�牛白蛋白的结合物变形，从而使疫苗接种动物产生抗牛白蛋白lgE，出现过敏反应。

抗生素 国外最多应用的是新霉素，国内均用青链霉素，庆大霉素和卡那霉素。临床上新霉素常用于外用，而青霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素常用于肌肉和静脉注射；抗生素只能用在细胞制备阶段。国内企业多个生产步骤均添加抗生素，致使疫苗中抗生素含量较高，是导致疫苗不良反应原因之一；疫苗中使用新霉素引起的过敏反应的风险要小于青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素。

动物血清引起的问题 不需要的细胞、细菌、支原体过量生长；补体、免疫球蛋白、生长抑制因子等有害物质成分不明确，影响结果分析；探测、下游处理和纯化；微量遗留蛋白抗原性；中和抗体引起收率降低；突发污染支原体、病毒和朊病毒；诱导分化；不同批号有区别；地域、季节和个体区别；不确定因素多；价格昂贵等。

传代细胞培养注意的几个问题

前期工作 细胞瓶的新转瓶处理不到位，玻璃中的二氧化硅释放过多，对细胞有损伤；冲洗转瓶的最后一步应用去离子水，而不是注射用水；瓶子刷洗不过关；洗衣粉或洗涤剂残留；细胞瓶塞如用再生橡胶塞对细胞有毒性，建议使用硅胶塞；管道系统中细胞瓶塞上的管道使用所谓“不锈钢”管道对细胞有毒性，建议使用玻璃制成的管道，同时更换硅胶管。

营养液成分 水：注射用水应通过阴阳离子交换柱处理，经电导率仪检测；基础培养基来源：进口产品质量比较稳定可靠，国产产品批次间质量不稳定；基础培养基引起细胞凋亡。血清：过滤、钴60照射除菌。内毒素含量都很高，前者常常灭菌不彻底，后者可解决支原体污染，但照射剂量大易破坏生长因子等影响细胞贴壁。从节约成本角度考虑，建议采用碳酸氢钠即可满足生产要求。
 

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