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香猪生长激素基因多态性的研究

发布日期：2013年07月10日　来源：互联网
摘 要 利用 PCR-RFLPs 技术，检测香猪生长激素基因Apa I 和Msp I 酶切位点多态性，并分析不同基因型对个体初生重、 2 月龄体重、 4 月龄体重、 4 月龄体长和 4 月龄胸围等生长性能的影响。结果表明，香猪生长激素基因用 ApaI 酶切后产生 3 种基因型和 2 种等位基因，用 MspI 酶切时未发现多态性；在 ApaI 酶切突变位点上， AB 基因型和 AA 基因型香猪的 4 月龄体重极显著地低于 BB 基因型香猪（P <0.01 ）， 4 月龄体长也显著低于 BB 基因型香猪（P <0.05 ），提示 AB 和 AA 基因型可能是香猪矮小性的有利基因型。
关键词 香猪 生长激素基因 多态性 生长性能
猪生长激素（porcine growth hormone，pGH）基因是重要的生理功能基因，Vize等在1987年成功地克隆了pGH基因，该基因全长为2231 bp，由5个外显子和4个内含子构成。近年来，国内外学者已经对pGH基因的结构做了大量基础性工作，目前的研究主要偏向于多态位点的寻找，研究区域主要集中在5′端至外显子3起始处，已在多个猪种间进行了多态性的比较（宋成义等，2001），但至今为止未见对香猪等小型猪进行多态性及其与生长性能关系的研究报道。香猪是我国特有的珍稀小型猪种，其很多生理生化指标与人类相似，且体型矮小、生长缓慢，适合于进行反复采样、外科手术和术后管理，因而是理想的生物医学研究用实验动物（郝光荣，2002）。为此，本实验利用限制性片段长度多态性方法研究香猪pGH基因的酶切位点多态性，并比较不同基因型香猪的早期生长性能，寻找对香猪矮小性有利的基因型，为香猪资源的保护和更好的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
上海交通大学农业与生物学院小型猪繁育场的香猪57头，这些猪系同一季节出生的、来自不同窝的幼母猪，饲料营养水平一致。取耳组织样品于干净小瓶中，置-70℃冰箱备用。
1.2 试验方法
1.2.1 基因组DNA的提取
采用酚-氯仿抽提法提取香猪基因组DNA，并置-20℃保存备用。
1.2.2 引物及PCR反应
采用Stanford大学引物设计软件设计引物，并由上海捷倍思基因公司合成。上游引物：5′-TTATCCATTAGCACATGCCTGCC-3′；下游引物：5′-TACCTCTGTCCCTCCGGGATGTA-3′。
PCR反应体系：10×PCR Buffer 5.0 μL，25 mM MgCl 2 3.0 μL，10 mM dNTP 1.0 μL，上游引物（20 μM）1.0 μL，下游引物（20 μM）1.0μL，Taq DNA polymerase（3 U/μL）0.5 μL, 模板（50 ng/μL）3.0 μL, 加水至50.0 μL。PCR反应条件：94℃预变性4 min；94℃变性50 s，67℃退火50 s，72℃延伸70 s，共30个循环；72℃延伸10 min。
1.2.3 酶切反应
反应体系：PCR扩增产物12.5 µL，Buffer 2.5 µL，BSA 2.5 µL， ApaI 0.8 µL（或 MspI 0.8 µL），加水至25 µL。酶切反应条件为37℃，3.5 h。取酶切产物12 µL进行琼脂糖凝胶电泳，在Tanon计算机凝胶成像系统上观察酶切效果、多态性并照相。
1.2.4 统计分析
香猪生长性能计算、方差分析，均采用SPSS 11.5软件包。
2 结果与分析
2.1 ApaI 酶切结果
对香猪 pGH 基因的 -119 到 +715 区域共 834 bp 片段的扩增产物用Apa I 内切酶酶切后，检测到一处酶切突变位点，构成 A （ 449 bp ， 283 bp ， 102 bp ）和 B （ 316 bp ， 283 bp ， 133 bp ， 102 bp ） 2 个等位基因，由此产生 AA 、 BB 、 AB 三种基因型（见图 1 ）。Apa I 酶切多态位点的基因型频率和等位基因频率的统计结果见表 1 ，从表 1 可见，香猪群体中 AB 基因型的频率最高， AA 基因型次之， BB 基因型的频率最低；等位基因 A 的频率高于等位基因 B 。经测序发现，等位基因 A 是由位于第 1 内含子的 +295~+300 位处的酶切位点缺失所造成，导致切点缺失的原因是Apa I 识别序列（ 5′GGGCC↓C3′ ）中第 2 个 G 突变为 A 。

图片1

表 1 香猪Apa I 酶切后的基因型频率与基因频率
基因型频率
等位基因频率
AA
BB
AB
A
B
31.58% （ 18 ）
22.81% （ 13 ）
45.61% （ 26 ）
54.39%
45.61%
注：括号内数字为不同基因型的个体数。
2.2 MspI 酶切结果
香猪pGH基因-119到+715区域的扩增产物用 Msp I内切酶酶切后，共检测到3个酶切位点，但在各酶切位点没有发现多态性，各个样品的电泳图中均显现137 bp、 172 bp、373 bp三条条带。
2.3 ApaI 酶切位点不同基因型对香猪早期生长性能的影响
香猪pGH基因 ApaI突变位点不同基因型对早期生长性能的影响见表2。由表2可见，香猪在初生重、2月龄体重、4月龄体重、4月龄体长和胸围方面均以BB基因型为最大，而AB基因型和AA基因型的香猪在各项指标上相近。经方差分析可知，BB基因型香猪的4月龄体重极显著地大于AB基因型和AA基因型香猪（ P<0.01），4月龄体长也显著大于AB基因型和AA基因型的香猪（ P<0.05）；AB基因型与AA基因型香猪之间在各项指标上差异均不显著（ P>0.05）。
表 2 不同基因型对香猪生长性能的影响
基因型
AA
BB
AB
数量
18
13
26
初生重
0.58±0.05
0.61±0.05
0.59±0.05
2 月龄体重（ kg ）
6.48±0.57
6.85±0.47
6.50±0.61
4 月龄体重（ kg ）
16.01±0.94 Aa
17.06±1.16 Bb
15.94±1.05 Aa
4 月龄体长（ cm ）
55.11±4.80 a
58.46±3.82 b
54.65±4.45 a
4 月龄胸围（ cm ）
49.83±4.52
52.69±3.56
50.06±4.55
注：同一行数据上角标注不同大写字母者差异极显著（ P<0.01）， 标注不同小写字母者差异显著（ P<0.05） 。
3 讨论
3.1 香猪 pGH 基因Apa I 酶切位点的多态性
本实验对香猪pGH基因5′端调控区至外显子3起始区进行扩增，涉及到绝大部分学者对pGH基因所研究的区域。用 ApaI对扩增片段进行酶切后发现3个酶切位点，其中在+295~+300的酶切位点呈现多态性，因而构成A、B 2个等位基因，产生了AA（449 bp，283 bp，102 bp）、BB（316 bp，283 bp，133 bp，102 bp）和AB（449 bp，316 bp，283 bp，133 bp，102 bp）3种基因型，经测序得知等位基因A是由位于第1内含子的+295~+300位处的酶切位点缺失所造成。Larsen等（1995）用PCR-RFLPs方法分析了丹麦4个猪种pGH基因-119~+486区域，发现 ApaI于+295~+300处存在酶切位点多态性；宋成义等（2001）在对姜曲海猪pGH基因进行 ApaI酶切后也发现了+295~+300的酶切多态位点，本实验结果与之相符，说明我国小型猪种——香猪与众多国内外猪种一样，在pGH基因中同样呈现 ApaI酶切位点多态性。
王文君等（2003）对中外10个猪种pGH基因 ApaI多态位点的检测结果显示，我国地方猪种的BB基因型频率明显比国外猪种低，在大部分猪种中AB基因型的频率是3种基因型中最高的；我国地方猪种等位基因A的频率全部大于50%。本研究中香猪在该位点BB基因型频率为最低（22.81%）、AB基因型频率最高（45.61%），等位基因A的频率达54.39%，这些结果均与上述报道的国内地方猪种情况一致。
3.2 香猪 pGH 基因Msp I 酶切位点的多态性
Kirkpattick（1992）在对大约克夏公猪pGH基因+206~+711片段扩增、酶切后检测到了 Msp I多态位点，在我们以前对大约克夏猪 Msp I酶切研究中也发现多态性，其部分个体多出一个274 bp的条带，而本试验在香猪中未检测到 Msp I酶切位点的多态性。经测序并对照公布的序列（M17704）后得知，香猪没有出现274 bp的条带是由于在+563~+566位产生了一个新的酶切位点（ Msp I识别序列为5′C↓CGG3′），该切点序列中的第2个碱基C是由原来的碱基T突变而成，从而使274bp的条带全部酶切成了两条重叠的137 bp的条带；但在大约克夏猪群体中的部分个体未发生此种突变，即没有出现该酶切位点，故使大约克夏猪种群在该位点呈现多态性。
3.3 香猪 pGH 基因不同基因型与其早期生长性能的关系
实验结果显示，不同基因型对香猪初生重、2月龄体重和4月龄胸围的影响都无显著性差异（ P>0.05），但是，AB、AA基因型香猪的4月龄体重极显著地小于BB基因型香猪（ P<0.01）；4月龄体长也显著小于BB基因型香猪（ P<0.05）。宋成义等（2001）在对姜曲海猪pGH基因进行 ApaI酶切后发现，G4G4基因型（相当于本研究中BB基因型）个体的20日龄体重、45日龄体重高于另2种基因型的个体，但差异不显著，而G4G4基因型个体的70日龄体重和0~70日龄日增重极显著高于另2种基因型的个体，该现象与本研究结果基本一致。WANG等（2002）对南昌白猪和大约克夏猪pGH基因的扩增产物用 ApaI酶切，并分析了不同基因型对个体初生重、2月龄重、4月龄重、6月龄重、平均背膘厚等性能的影响，结果表明各项指标都存在一定差异，但差异不显著（ P>0.05），这与本研究结果不尽一致，可能是他们所研究的是大体型猪种的缘故。本研究结果提示，pGH基因的不同基因型对香猪生长性能产生着影响，AB、AA2种基因型的香猪明显比BB基因型的香猪体型小、生长缓慢，AB和AA基因型可能是香猪矮小性的有利基因型。
参考文献
[1] Vize P D and Wells J R E. Isolation and characterization of porcine growth hormone gene [J]. Genetics, 1987, 55: 339-344
[2] 宋成义 , 经荣斌等 . 猪 GH 基因部分突变位点对生产性能的影响 [J]. 遗传 , 2001, 23(5): 427-430
[3] 郝光荣 . 实验动物学 ( 第 2 版 )[M]. 上海 : 第二军医大学出版社 , 2002. 144-149
[4] Larsen N J, Ellegren H, Brauner － Nielsen P, et al. Genetic variation at the growth hormone locus in a wild pigintercross: test of association to phenotypic traits and linkage to blood group D locus[J]. Theoretical and Applied Genetics, 1995 (91): 1074-1077
[5] 王文君 , 陈克飞等 . 中外不同猪品种生长激素基因遗传多态性检测 [J]. 农业生物技术学报 , 2003, 11(1): 103-104
[6] Kirkpattick B W. HaeⅡ and Msp I polymorphisms are detected in the second intron of the porcine growth hormone gene[J]. Animal Genetics[J], 1992, 23(2): 180-181
[7] WANG W J, CHEN K F, REN J, et al. Relationship of growth hormone (GH2) genotypes with some production performances in pig[J]. Acta Genetica Sinica, 2002, 29 (2): 111-114
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