木聚糖酶活性的测定

目前普遍使用的分析木聚糖酶的方法，主要包括还原糖法、黏度法和以染色底物为基础的方法。①还原糖和黏度分析法：还原糖分析法没有专一性，不能用来测定饲料中少量木聚糖酶的活性。但Nelson/Somogyi还原糖法仍然不失为测定纯木聚糖酶制剂的标准方法。黏度分析法的底物通常是小麦木聚糖(黏度为20cSt～30cSt)，也有用其他的，如来源于燕麦和桦木的木聚糖底物的。黏度分析法主要用来分析内切酶的活性。②可溶性的显色底物法：已有各种染色底物用来分析内切1,4-β-D-木聚糖酶。这些底物包括染色的燕麦木聚糖、桦木木聚糖、山毛榉木聚糖和小麦木聚糖。比较三种可溶性染色木聚糖底物的相对灵敏度，azo-小麦阿拉伯木聚糖的灵敏度是最高的。③不可溶显色底物法：通过染色和交链制备不可溶的木聚糖，这些木聚糖包括燕麦木聚糖、桦木木聚糖和小麦阿拉伯木聚糖，用这些木聚糖制备水不溶的有色底物。④酶联吸附剂分析法：用来分析饲料中β-葡聚糖酶和木聚糖酶活力的酶联吸附剂分析法(ELSA)。这种分析法的灵敏度比前面描述的所有方法都高。

β-葡聚糖酶活性的测定

可以作用于β-葡聚糖的酶很多，包括内切真菌纤维素酶和细菌β-葡聚糖酶。①还原糖法：采用还原糖法和黏度法，以纯的β-葡聚糖(从大麦或燕麦中提取)为底物可以直接用来测定β-葡聚糖酶和纤维素酶。通常是比色法(即Nel-son/Somogyi法)，显色反应与不同聚合度的同源寡糖的还原性末端的含量成比例，由此可以测量酶活。②黏度分析法：Nelson/Somogyi还原糖法是测定较纯的β-葡聚糖酶活性的理想方法。对于饲料中的酶活，需要使用黏度法和以使用染色多聚糖作为分析底物的方法，这两种方法能特定地测定内切水解酶活力，能够在还原糖本底较高的情况下测定酶活。③琼脂平板扩散法：将酶样添加在平板的孔穴中，在含有特定底物的平板上扩散。酶活是通过跟踪平板上特定的染色多糖底物的颜色变化来测定的，但是只能是半定量的。④可溶性染色底物法：可溶性底物包括azo-CMC和azo-大麦葡聚糖。azo-大麦葡聚糖的灵敏度大约是azo-CMC的3倍。但是该方法并不适于测定动物饲料中微量纤维素酶的活力。⑤不可溶解的染色底物法：不可溶解的染色底物是通过染色和交链可溶性的多糖产生染色的交链多糖凝胶物。用这些底物进行分析，灵敏度要比使用azo-大麦葡聚糖和azo-CMC高3倍～10倍。

α-半乳糖苷酶活性的测定

α-半乳糖苷酶作用水解半乳糖―蔗糖形式的寡糖(棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖)产生半乳糖和蔗糖。α-半乳糖苷酶的优选底物是p-硝基苯酚-α-半乳糖苷(10mM)。对于特定的α-半乳糖苷酶，水解p-硝基苯酚-α-半乳糖苷、棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖的相对速度以便确定这些酶确实对需要作用的组分发生作用。α-半乳糖苷酶水解半乳糖―蔗糖结构的寡糖的活力也可以通过Nelson/Somogyi还原糖分析法进行测定。

蛋白酶活性的测定

用于测定蛋白酶的底物和分析方法有很多种，许多是用天然蛋白质，如酪蛋白、凝乳蛋白和血红蛋白作为底物。这种分析方法是基于用三氯乙酸(TCA)沉淀未水解的底物，然后在235纳米处测定离心获得的上清液的吸光度。采用染色标准的或染色交链的蛋白作为底物专一性更好。目前已经有几种染色的蛋白质底物，包括用磺胺酸染色的白蛋白、酪蛋白和胶原蛋白(azo-白蛋白、azo-酪蛋白和azo-胶原蛋白)，胶原蛋白用灿烂蓝染色。另外有一种广泛使用的内切蛋白酶底物，称为cowhide苯胺蓝(用灿烂蓝染色的胶原蛋白)。还有一种以胶原蛋白为基础的底物，它是用通过染色和交链从鱼鳍中提取的胶原蛋白制备的，其胶原蛋白的结构与cowhide中的组分很相似。以Prota-zymeAK作为测活底物，灵敏度要比azo-酪蛋白高4倍～5倍。即使采用更高灵敏度的底物，要准确分析配合饲料混合物中的酶活仍然是很困难的。采用荧光底物可以满足所需要的灵敏度，然而仍然需要解决饲料成分对酶蛋白的吸附和特定酶蛋白抑制物对酶活力的抑制等问题。

植酸酶活性的测定

测定植酸酶的活力，通常是测定在一定的作用时间内，从植酸溶液中水解释放出的正单磷酸量。一个单位的植酸酶活力定义为：在测定条件下(pH值5.5，37℃)，1分钟内水解植酸释放1μmol无机磷所需要的酶量。

相关文章