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猪轮状病毒感染研究进展

发布日期:2013年07月10日 来源:互联网

猪轮状病毒感染是由猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,PRV)引起的一种传染病,也称胃肠炎。此病多发于仔猪。主要表现为厌食、呕吐、腹泻、脱水等症状。育成猪和成年猪通常为隐性感染。

Woode和Bridge1975年首次从猪中分离出轮状病毒,目前本病已广泛分布于五大洲,并引起严重经济损失[3]。以英国为例,1~4周龄仔猪群发病率超过80%,死亡率7%~20%[4]。我国兽医工作者也从仔猪的腹泻粪便中检出RV。

1 病原学

猪轮状病毒(RV)属于呼肠弧病毒科轮状病毒属的A、B、C、E 群[4]。成熟完整的病毒粒子略呈圆形,没有囊膜,具有双层表壳,直径为65~75nm的二十面体对称。电镜观察,病毒的中央为一个电子致密的六角形棱心,直径37~40nm,即芯髓;周围有一电子透明层,壳粒由此向外呈辐射状排列,构成中间层衣壳;外周为一层光滑薄膜构成的外层衣壳,厚约20nm,形成一个轮状结构,RV由此而得名[5]。在感染的粪样和细胞培养物中均存在两种形式的病毒粒子:具有双层表壳的光滑型(S型)双层颗粒,有感染性,直径为75nm;没有外表壳的粗糙型(R型)单壳颗粒,无感染性,直径为65nm。

有关RV的超微结构,学者们的意见尚不一致,Martin等(1975年)认为RV与环状病毒一样,也有32个大的环形壳粒,且其180个三联亚单位按T=9的、方式组成20个三角面体。每个三联亚单位包含3个结构单位,所以一共有540个结构单位。但据Esparza(1978年)报道,RV表面有162个孔,由320个三联亚单位按T=9方式组成20个三角面体。因每个三联亚单位包含三个结构单位,所以一共有960个结构单位。出现上述不同的观察结果,也许是标本制作方法不同的缘故。Stannard氏等(1977年)对乳鼠流行性腹泻轮状病毒和猴RVSA11株进行了细致的电子显微镜观察,发现其内衣壳有180个形态亚单位,排列成晶格状。12个顶各为一个空隙,由5个壳粒围绕,另外80个空隙各由6个壳粒围绕。外衣壳由蜂窝样的晶格组成,且与内衣壳的晶格排列相符。

1.1 分子生物学特性

通过X-射线晶体结构研究发现,完整的病毒粒子具有复杂的结构。最外层核衣壳由结构蛋白VP7和VP4组成,中间层衣壳由VP6组成,最内层衣壳由VP2和少量的VP1、VP3组成。VP7是构成外衣壳最丰富的外壳蛋白,是分子量为37KD的糖蛋白。VP4是88KD的红血球凝集素纤突蛋白,沿VP7形成的光滑表面向外突出。不完整的病毒粒子是完整的病毒粒子在进入被感染细胞过程当中外衣壳蛋白VP4和VP7被溶解掉而形成的两层核衣壳结构(DLP)。除了VP4、VP7、VP6、VP2、VP1和VP3这6种结构蛋白以外,还有5种非结构蛋白,分别是NSPl、NSP2、NSP3、NSP4和NSP5。

病毒的基因组由11个独立片段的双股正链RNA组成。除了片段11具有两个开放阅读框(0RD)外,其他的片段只有1个ORF。在各个ORF的5’端和3’端都有非编码区(UTRs ),不同毒株的UTRs高度保守,而ORF的差异比较大。轮状病毒的mRNA分子具有5’端m7GpppGn帽子结构,而3’没有Poly(A)尾。ORF的基因编码结构蛋白和非结构蛋白,两端的UTRs可能与调节蛋白的结合以及核酸的复制、表达有关。

早期的研究结果认为VP7与病毒的附着有关,但现在越来越多的证据表明VP7具有稳定VP4结构的作用。在病毒侵入细胞的过程当中VP4起到关键作用。VP4能被胰蛋白酶(Trypsin) 分解为VP5(60KD) 和VP8(26KD) 两个结构部分,与病毒附着、聚集有重要关系, 可以数倍提高轮状病毒的感染性[7]。VP5含有一个与有膜病毒如流感病毒类似的区域,它能增加细胞膜的渗透性,加强病毒进入细胞的能力。VP8含有唾液酸附着(Sialic acid binding)的区域,这一区域对于需要硅酸进行感染的轮状病毒亚单位来说至关重要。VP6与内衣壳蛋白VP1和VP3的转录活性有关[8]。VP4和VP7被溶解掉之后,VP1和VP3的转录酶活性被激活,转录产物被合成和排出。最内层的病毒粒子衣壳由包裹基因组的VP2、VP1、VP3组成,基因组核酸通过VP1、VP3与VP2紧密相连。VP1和VP3具有RNA转录酶和修饰酶的潜在活性。

非结构蛋白NSP1、NSP2、NSP3、NSP5都是RNA结合蛋白,与病毒的复制,合成和表达有关。NSP5可与VP2作用,进而影响VP1/2/3的核心结构,同时也能影响VP6的稳定性。而NSP4是一种糖蛋白,与病毒粒子从内质网出芽有关,在病毒的复制以及致病机理方面具有重要作用。NSP4的突变可以影响病毒的毒力。

1.2 病毒分型

轮状病毒具有不同的群型和血清型。将轮状病毒的核酸进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,可以将病毒的11个双链RNA片段分离,形成特定的电泳带模型。这11条带可以分为4个区段,常见的人和动物的电泳带的排列位置为4:2:3:2,统称为A群,又叫典型RV。根据第1O和11节段之间的距离,又分为长型和短型。其他的轮状病毒的电泳型与A群不同,分别为B、C、D、E、F和G群,统称为非典型RV。在发生腹泻的动物中最常见的是A群,感染猪的轮状病毒有A群、B群、C群和E群。

病毒粒子表面共有三种抗原,分别为群抗原,中和抗原和血凝素抗原。群抗原是VP6,中和抗原是VP7,而血凝素抗原是VP4。根据群抗原VP6可以分为不同的亚群。大多数动物的A群轮状病毒为I亚群,而人类大多数A群轮状病毒为Ⅱ亚群。VP4和VP7在病原的检测和产生中和抗体以及免疫性保护过程中具有重要意义,可以根据VP4和VP7分为不同的血清型系统。根据VP4形成的血清型叫P(protease sensitive)型,根据VP7形成的血清型叫G(glycoprotein)型。轮状病毒不同血清型之间的交叉反应性较差,免疫反应主要是针对特异血清型的,但现在也有报道利用交叉免疫保护的。目前已经知道至少有14个G型和18个P型。通过轮状病毒的分子流行病学调查发现,在世界广泛流行的A组RV主要有4种G、P血清型组合, 分别是G1P8、G2P4、G3P8和G4P8。从各大洲分离的仔猪的基因型主要有以下两种:类OSU型和类Gotfield型。

1.3 理化特性

RV对理化因素的作用有较强的抵抗力,所以清洗和消毒猪舍时必须注意此特点。它耐乙醚、氧仿、去氧胆酸钠、次氯酸盐;反复冻融,声波处理。以及37℃下1h仍不失活;pH3.5~10.0范围内病毒保持感染力,对胰蛋白酶稳定,1moL/LMgCL2不能增高其对56℃30min的稳定性;粪便中的RV在18~20℃室温中经7个月仍有感染性;能耐10mL/L甲醛1h以上;氯、臭氧、碘、酚等可灭活病毒;100g/L聚维酮碘、950mL/L乙醇和670g/L氯胺T是有效的消毒剂[4~5]。

1.5 抗原性

RV与呼肠孤病毒和环状病毒无抗原关系,但用补反结合试验、免疫荧光试验和免疫扩散试验和免疫电镜技术检测各种动物的RV,发现具有共同抗原---出现交叉反应。这种共同抗原与内衣壳有关,也就是说,内衣壳具有各种RV共有的属抗原。外衣壳内糖蛋白抗原有种特异性,交叉保护试验或中和试验可区别各种动物RV,但Thouless氏等(1977年)对人、牛、猪、小白鼠、狗、羊、马和兔的RV作交叉中和试验,发现高浓度的抗血清可能引起一定程度的种间交叉现象,但同源血清的中和效价通常都比异源血清高8—10倍以上。1976年Woode氏等应用免疫电镜技术测人、牛、猪、小白鼠、马等RV抗原性关系,发现抗人RV免疫血清以外,其余四种血清能对四种动物RV呈现交叉凝集现象,人的R型也可以被四中抗血清凝集,但S型只能被人抗RV血清凝集。证明动物感染RV后产生两中抗体:抗内衣壳的群特异性抗体,产生种间交叉反应。抗外衣壳的种特异性抗体,中和抗体或保护性抗体作用。

1.4 培养特性

1980年美国的Waytt将人的Wa株首次利用非洲绿猴肾原代细胞培养成功。轮状病毒在体外不易培养。轮状病毒在培养的过程中需要用胰酶处理,病毒接种前用终浓度为10ug/ml的胰酶处理。病毒接种24h后就可出现细胞病变,表现为细胞肿大变圆、边缘模糊、细胞聚集、萎缩,有的细胞间有胞浆相连,最后细胞死亡脱落。随着传代次数的增加,病变程度加深,出现病变的时间也越来越快。病毒接种后一般用不含血清的维持液培养。但是黄旭雯等人在研究鸡血清对轮状病毒增殖的影响中发现,鸡血清(CS)能增加单层细胞的活力,延迟细胞衰老2~3d,但细胞对病毒的易感性降低。同时添加4%的CS和10mg/L的胰蛋白酶效果最好,细胞病变明显,细胞单层能维持到被病毒破坏为止,有利于RV的复制。

轮状病毒感染细胞具有特定的趋向性。在体内只感染肠绒毛的上皮细胞,在体外尽管可以吸附许多细胞,但是只感染肾或肠道上皮细胞来源的细胞。轮状病毒可以在MA-104、CV-1、MARC-145等细胞系培养,但最适合用MA-104培养。Carlos A.Guerrero等人通过不同的方法处理MA-104细胞,然后用RRV,SA11,SA感染来检验细胞上的受体,结果发现N-多聚糖(N-glycans)、神经节苷脂(gangliosides)、胆固醇类(cholestero1)及其相关的蛋白质是不同基因型的轮状病毒侵入细胞的不同受体。

2 流行病学

2.1 传染源

病猪、隐性感染及带病毒者是本病的传染源,由于后两者不易被发现,因而起着重要的传染源作用。

2.2 传播途径

RV通过密切接触尤其是粪-口途径引起传播或流行;呼吸道传播和垂直传播也已被证实。

2.3 易感动物

自然情况下,多发于2~56日龄仔猪,成年猪感染不会发生严重的临床症状。KaminjoIo JS等的实验表明RV检出率最高的仔猪周龄为2~8周龄(91.1%),检出率峰值为8周龄仔猪。Gelerg等发现仔猪体内排出RV的峰值周龄是3~4周龄。Morilla认为非典型RV感染仔猪的日龄要小于A型,因母猪不能通过被动免疫保护其仔猪口。RV感染具有明显的季节性,高峰在晚秋及冬季,步数地区季节性不明显而呈终年流行。散发,偶见爆发。一旦发生本病,随后将每年连续发生,因为RV在体外有较强的抵抗力,且隐性感染的成年动物不断向外排毒。

3 临床症状

病初,病猪精神不振,食欲不良,不愿活动。随后出现呕吐和腹泻。腹泻是本病的主要症状,粪便呈黄色、灰色或黑色,水样或糊样,严重者带有黏液和血液。腹泻3~4d后,部分病例出现严重脱水。此病多在2~3d内恢复,死亡率一般为10%。如继发其他疾病,使病情恶化,死亡率可达10%~20%。

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4 病理变化

病猪严重脱水,皮毛粗糙。病变位置只局限于小肠,在小肠的后2/3至1/3处的肠壁变薄,通透性增大,呈半透明状,小肠绒毛萎缩。小肠内部含有大量的黄色或灰黄色的液体或絮状物,有腥臭的气味。胃壁弛缓,内含有白色的凝乳块,盲肠和结肠有黄色或褐色的内容物且呈膨胀状。

5 发病机制

发病机制病毒经口进入小肠,在胰酶的作用下,病毒被激活,感染小肠绒毛顶部上皮细胞,并在其中增殖,使绒毛上皮细胞死亡,绒毛萎缩,隐窝鳞状上皮细胞代偿性分裂,导致肠内容物吸收障碍,肠壁内外的渗透压比发生改变,体内的离子和水分向肠腔分泌,造成肠腔内液体蓄积,临床上表现为水样腹泻。由于水分和电解质的损失,进一步引起脱水和酸碱失衡,严重者可以引起死亡。

6 诊断

6.1 通过流行病学、临床症状、病理变化等对该病进行初步诊断,确诊需要实验室检验。

6.2 实验室诊断

6.2.1 电镜观察(EM) 轮状病毒在电子显微镜下观察呈现特殊的轮状,将发生腹泻的仔猪粪便或小肠内容物离心,加双抗灭菌,然后用磷钨酸负染,在电镜下观察, 就会看到特异的的病毒粒子。

6.2.2 免疫荧光技术(FA) 采集发病早期的仔猪的空肠或内容物,刮取小肠绒毛作压片或涂片,用丙酮固定后再用猪轮状病毒荧光抗体染色,在荧光显微镜下观察,可以在绒毛上皮的胞浆内见到荧光。

6.2.3 ELISA 将酶标记抗体检验病料,如果有TGEV存在,则抗原和抗体结合,同时使酶对底物作用而显色。此种方法敏感易行,实用性强。

6.2.4 核酸电泳法 轮状病毒的核酸有11个节段,在PAGE电泳时呈现特异的电泳图谱,不仅能与其他病毒区别开,也能初步鉴定轮状病毒的群。这是研究轮状病毒分类学和流行病学最常见的方法。

6.2.5 RT-PCR 轮状病毒的核酸是RNA,通过反转录扩增,能够快速检出病毒。它的灵敏性高,适合早期诊断和分子流行病学检查。

6.2.6 核酸探针检测 刘明军等用光敏生物素标记A群轮状病毒的核酸,其敏感性接近于国内报道的非同位素探针水平,特异性好,适合于A群轮状病毒的检测。

7 防治

有关RV感染的治疗研究不多。

7.1 搞好环境卫生

对猪舍定期清洗,消毒。在寒冷的季节要注意保暖,提高母猪和仔猪的抵抗力。同时猪舍实行全进全出制,分娩舍和保育舍要分开,作好隔离。工作人员要注意消毒和隔离,禁止外来人员进入和参观。

7.2 加强免疫

7.2.1 非特异性免疫 由于轮状病毒是肠道病毒,因此非特异性免疫特别是黏膜免疫在轮状病毒的预防当中具有重要作用。黏膜免疫可以通过口服途径进行。Shing C等人发现将轮状病毒核酸疫苗用硅藻酸盐包裹,可以在肠道中产生高水平的IgA。

7.2.2 传统疫苗 传统疫苗包括灭活苗和弱毒苗。灭活苗的抗原性不高,通常需要添加佐剂。弱毒苗在仔猪体内可以增殖,有一定的保护性。油佐剂灭活苗在怀孕母猪分娩前30d免疫,仔猪在出生后7d和21各免疫1次。弱毒苗在分娩前5周和2周各免疫1次。

7.2.3 异源疫苗 轮状病毒不同血清型之间的免疫交叉性较差,一般用同一血清型的疫苗免疫,效果较好。但有报道称轮状病毒感染也可以通过异源疫苗来免疫。异源苗免疫的主要机制是利用VP6的保护作用。

7.2.4 亚单位疫苗 现在已经在大肠杆菌等表达系统中成功的表达了轮状病毒不同的结构蛋白,为研究不同结构蛋白的作用以及亚单位疫苗的研制,提供了可能。

7.2.5 核酸疫苗 核酸疫苗是新兴的第三代疫苗。核酸免疫的具体机制还不太清楚,大多数人认为基因被摄入宿主细胞,利用宿主细胞的表达系统产生免疫抗原,启动机体的细胞免疫和体液免疫,共同抵抗特异病原的攻击。

7.2.6 被动免疫 母源抗体可以防止仔猪感染轮状病毒,即使感染,发病程度也较轻,发病率和死亡率大大减少,感染的程度与母源抗体的滴度有关。

7.3 如果发现仔猪感染轮状病毒,立即将病猪隔离到清洁、消毒、干燥温暖的环境中去,加强护理,对症治疗。对有感染威胁的仔猪或母猪要及时接种预防,使群体平均抗体水平迅速提高,增强对轮状病毒的抵抗力。

8 存在问题及展望

RV基因组分11节段,核苷酸序列常因基因漂移转移、重组等造成RV的变异多样性。病毒蛋白复杂多样且不同血清型RV之间的免疫交叉性很差,给RV免疫及疫苗研制带来困难。所以,研制一种能够广泛交叉保护不同血清型RV感染的疫苗,具有重要意义。近几年对RV疫苗的研究获得了突破性进展。陈元鼎等用RHV-RNA2载体系统中表达的(RV)VP4;胰酶切割位点区抗原表位可诱导动物产生具有交叉中和反应的血清抗体。可作为新一代RV抗原表位亚单位疫苗的侯选疫苗抗原[16]。目前已将VP4、VP7在大肠杆菌、痘病毒、腺病毒、杆状病毒中表达成功,获得了融合蛋白,但效果还不理想。因此,如何制备高效的融合蛋白是努力的方向[17]。许多新的免疫方法如作亚单位疫苗的病毒颗粒、DNA疫苗、微量化病毒疫苗和其他的RV口服活疫苗以及肠道外免疫方法也在试验之中[5]。基因重配技术的发展有望给RV活疫苗的研究提出一条新途径。

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